动物细胞工程(一)

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动物细胞培养细胞融合核移植

动物细胞工程(一)

看清动物细胞培养、融合与核移植的原理、操作步骤和适用边界

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动物细胞培养细胞融合核移植

动物细胞工程(一)

看清动物细胞培养、融合与核移植的原理、操作步骤和适用边界

1第 1 页 · 动物细胞工程(一)

动物细胞培养流程设计与操

厨师做菜要选食材、控火候、保卫生,细胞培养在体外重现这套逻辑——取材、控环境、防污染,每一步都不能省。

体外培养
把动物细胞从体内取出,在人工环境里让其存活与增殖
组织解离
用胰蛋白酶等把组织分散成单细胞悬液
培养基配制
含糖、氨基酸、血清,模拟体内营养与 pH
无菌环境
器具、操作台、培养液全部灭菌,阻止微生物入侵
传代与冻存
细胞长满后分瓶继续养,多余细胞低温冻存保留种源
养鱼缸对应 →动物细胞培养

水对应培养基、温度对应37℃、氧气对应CO₂控pH、换水分瓶对应传代

2第 2 页 · 动物细胞培养流程设计与操

无菌操作与污染控制

无菌操作与污染控制:定义、要点与典型应用

无菌操作与污染控制
无菌操作与污染控制:定义、要点与典型应用
3第 3 页 · 无菌操作与污染控制

组织消化/分散制备单细胞

组织消化/分散制备单细胞悬液:定义、要点与典型应用

组织消化/分散制备单细胞
组织消化/分散制备单细胞悬液:定义、要点与典型应用
4第 4 页 · 组织消化/分散制备单细胞

传代与分瓶培养操作

上一页我们把组织消化成单细胞悬液。但细胞装在瓶子里会越养越挤——什么时候该换大房子?换几套?这就是传代与分瓶要解决的事。

传代培养
细胞汇合度达80%~90%时,重新消化分散,转移至新培养瓶继续培养
传代比例
常用1:2或1:3,根据细胞增殖速度与实验目的灵活调整
传代时机
对数生长期最佳,避免过满(接触抑制)或过稀
消化控制
胰酶作用1~3分钟,细胞变圆脱落即可终止
代数与衰老
有限细胞系传10~15代后增殖减缓,需关注代数
合租公寓住满要分房搬家对应 →细胞传代与分瓶

住满就搬(传代),一套变多套(比例),住松快了细胞才好长

5第 5 页 · 传代与分瓶培养操作

动物细胞工程

你已经会培养动物细胞了——这只是动物细胞工程的敲门砖。真正让这门学科站住脚的,是培养之上"融合、改写、重编程"这一整套细胞改造技术。

学科定义
以工程学思路在细胞与分子水平改造动物细胞的技术体系
三大技术板块
细胞培养打基础,细胞融合造杂交瘤,核移植与干细胞做克隆
应用领域
医药(单抗、疫苗)、农业(畜牧改良)、科研(疾病模型)
学科边界
与植物细胞工程、微生物发酵工程并列,三者各管一类生物
细胞改造车间对应 →动物细胞工程

原料是动物细胞,设备有培养罐、融合仪、显微操作台,产出抗体、疫苗、克隆动物

6第 6 页 · 动物细胞工程

动物细胞培养

动物细胞培养:定义、要点与典型应用

动物细胞培养
动物细胞培养:定义、要点与典型应用
7第 7 页 · 动物细胞培养

合成培养基

上一页我们用培养基养细胞,但你有没有想过——这瓶橙黄色液体里到底装着什么?早期养细胞其实用的是动物自身体液,效果不可控,于是科学家开始自己「配」。

天然培养基的局限
来自血浆、鸡胚浸出液等动物组织提取物,成分复杂、批次差异大,难以保证实验可重复
合成培养基
由无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素等化学组分按精确配方配制,成分完全明确
半合成培养基
合成培养基基础上补加 5–10% 血清等天然成分,现阶段实验室最常用
研发的核心意义
解决可重复性问题;便于研究单一变量对细胞的影响;推动细胞培养走向标准化
延伸:无血清培养基
完全去除血清以避免批次差异与病原风险,需补加生长因子等,造价高,是发展方向
配方奶粉对应 →合成培养基

配方奶粉把每种营养精确到 mg,鲜牛奶天然但批次波动大——这正是科学家从天然走向合成培养基的动机

8第 8 页 · 合成培养基

血清(培养添加物)

合成培养基解决了糖、氨基酸、无机盐、维生素的来源,但真正养过细胞的人都知道:少了血清这一勺,细胞就是不贴壁、不增殖。为什么基础配方还缺这一口?

血清的来源
多取自胎牛血液,离心去除血细胞后的上清液,简称 FBS
为何必须加血清
提供生长因子、贴壁因子、脂质等未知成分,合成培养基独缺这些
关键成分
生长因子、激素、贴壁蛋白、转运蛋白、脂质、微量元素
血清的双刃剑
成分不明确、批次差异大、可能携带病毒与支原体、有伦理争议
无血清化趋势
为求成分明确、可重复,正发展化学限定培养基与无血清替代
老火靓汤底对应 →血清添加物

成分复杂、营养丰富却说不清配方,不同批次味道还不一样

9第 9 页 · 血清(培养添加物)

培养液(液体培养基)

前两页我们分别看过合成培养基和血清——真正送到细胞面前的,是把它们按比例调好的「培养液」。它不是单一化学品,而是一整套配方。

配制逻辑
合成培养基打底,加血清补未知因子,再调 pH、渗透压、加入抗生素
为何用液体
动物细胞无细胞壁,营养要均匀接触;固体培养主要用于筛选克隆
关键理化参数
pH 7.2~7.4、渗透压≈300 mOsm、5% CO₂ 维持碳酸氢盐缓冲
现配现用
4℃ 保存不超过 2~4 周;谷氨酰胺会自发降解产生氨毒
无血清趋势
成分明确、批次稳定,疫苗和细胞治疗等工业场景更受青睐
静脉输液配方对应 →培养液

基础电解质(合成培养基)+ 营养添加(血清)+ pH 缓冲——都把外液调到生理窗口

10第 10 页 · 培养液(液体培养基)

无菌、无毒环境(动物细胞

上一页讲了无菌操作——那是「动作」层面。这一页要看的是「环境」本身:动物细胞对环境有多挑剔?

无菌
细菌、霉菌、支原体在 37℃ 营养液里增殖远超动物细胞,几天即可压垮整瓶培养
无毒
器皿重金属、水中杂质、试剂降解物、代谢废物(乳酸、氨)累积都直接毒害细胞
温度恒定
哺乳动物细胞需 37±0.5℃,偏离 ±1℃ 即显著影响代谢与贴壁
气体环境
5% CO₂ 与 NaHCO₃ 共同缓冲 pH;O₂ 供细胞呼吸,常在培养箱中维持
pH与渗透压
pH 7.2~7.4,渗透压约 300 mOsm/kg,任一参数漂移都显著影响细胞存活
重症监护室对应 →动物细胞培养环境

温度≈体温监控,气体≈呼吸机,酸碱≈血液平衡——任何偏差都可能致命

11第 11 页 · 无菌、无毒环境(动物细胞

温度、pH和渗透压(动物细

温度、pH和渗透压(动物细胞培养条件):定义、要点与典型应用

温度、pH和渗透压(动物细
温度、pH和渗透压(动物细胞培养条件):定义、要点与典型应用
12第 12 页 · 温度、pH和渗透压(动物细

气体环境(动物细胞培养条

上一页讲 pH 要稳定在 7.2~7.4,但培养液放几小时就偏酸——靠什么实时纠偏?答案就藏在培养箱顶上那根气管里:CO2 在暗中与碳酸氢盐配合,把 pH 锚定住。

CO2 浓度
通常 5%,与培养基 NaHCO3 形成碳酸缓冲对,是稳定 pH 的关键
O2 作用
来自空气约 21%,支持细胞有氧呼吸
培养箱标准设定
95% 空气 + 5% CO2,同时控温、维持饱和湿度
边界与例外
HEPES 等非碳酸缓冲体系下,可脱离 CO2 培养箱
鱼缸增氧与碱度调节对应 →O2 供给与 CO2-pH 缓冲

增氧泵补 O2≈培养箱供 O2 给细胞呼吸;CO2 与水碱度平衡 pH≈CO2 与 HCO3- 缓冲稳定培养基 pH

CO2+H2OH2CO3H++HCO3CO_2 + H_2O \rightleftharpoons H_2CO_3 \rightleftharpoons H^+ + HCO_3^-
13第 13 页 · 气体环境(动物细胞培养条

本节要点

串联本节知识点,给出记忆锚点与易错提醒

本节要点
串联本节知识点,给出记忆锚点与易错提醒
14第 14 页 · 本节要点

课后思考

先自己思考,再对照参考答案。开放题没有唯一标准答案。

1为什么动物细胞培养通常需要加入血清?哪些成分是合成培养基难以替代的?

参考答案血清提供生长因子、激素、贴壁因子(如纤连蛋白)、脂质及某些未知微量组分。其中部分痕量因子至今未被鉴定,合成培养基暂无法完全替代。

2如果配好的培养液忘了放冰箱,在37℃放置一整天,还能继续用吗?为什么?

参考答案不能。37℃下葡萄糖降解、谷氨酰胺分解、pH漂移、抗生素失活,且微生物极易滋生。培养液应4℃避光保存,开封后一般不超过两周。

3动物细胞培养的“无菌”操作为什么比微生物培养更难?差异根源在哪?

参考答案动物细胞增殖慢、无自身抵抗力,培养周期长达数天,期间任何一次微量污染都会被时间放大;而微生物培养几小时就能见结果,发现更早。

15第 15 页 · 课后思考