目的基因制备
从基因组到表达载体：四种制备方法的原理、适用边界与实操陷阱
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目的基因制备
从基因组到表达载体：四种制备方法的原理、适用边界与实操陷阱
核酸提取
目的基因制备的第一步，是从细胞里'提'出 DNA——就像厨师做菜前得先去菜市场把食材买回家。我们从细胞这座'生物工厂'里，把目的核酸单独'提'出来。
矿石=生物样本；破碎矿石=裂解细胞；冲走泥沙=去除杂质；金粒=纯核酸
核酸检测
上一页把DNA/RNA从细胞里'捞'了出来——但捞到多少？纯不纯？有没有碎？这就是核酸检测要回答的三个问题。
称重看斤两、看色辨烂点、检外观看运输有无压坏
PCR原理
上一页核酸检测用的就是 PCR，但它怎么把一丁点 DNA 扩到够用？一段基因在一个细胞里可能就一份。PCR 就是试管里的「DNA 复印机」——几小时内把一段序列从几份扩到几十亿份。
引物=只夹那一章的书签；dNTP=墨水；Taq=复印机；变温循环=机器自动翻页复印，份数按 2ⁿ 翻倍
PCR影响因素
PCR影响因素：定义、要点与典型应用
反转录PCR及cDNA文库构建
前面学了PCR扩增DNA。但基因最初以mRNA形式表达，DNA里有内含子不能直接用——需要先把mRNA「翻译」成可操作的DNA。
录音（mRNA）听完即逝，文字稿（cDNA）可反复查阅、复印、归档
全基因组扩增及基因组研究
拿到微量 DNA 后，PCR 常只放大目标区域；研究整个基因组时，模板量往往不够。WGA 因而成为进入基因组研究前、先让材料“够用”的一步。
复印件足够多才便于阅读，但原件缺损会变成漏检，深浅不均也会在复制中被放大
工具酶
前几页我们走过了核酸提取、PCR、反转录 PCR 和 cDNA 文库——每一步能跑通，背后都靠一类蛋白质在催化。它们就是这一页要讲的「工具酶」，分子操作的「兵器库」。
菜刀切肉、剪刀剪葱、刨丝器刨丝——每把刀只做一件事，工具酶也只识别特定底物
本节要点
- ✓流程逻辑：从原料到可用片段，环环相扣的完整链条
- ✓PCR是核心扩增手段，保真性受模板、引物、温度等多因素制约
- ✓cDNA文库让RNA层面的遗传信息转化为可操作的DNA
- ✓全基因组扩增突破了微量样本的瓶颈
- ✓工具酶贯穿始终，是分子操作的底层基础设施
课后思考
先遮住答案自己想一会儿，再对照提示。开放题没有标准解。
参考答案mRNA是已剪接的成熟转录本，没有内含子；反转录得到的cDNA只含外显子，能在原核系统中正确折叠表达。
参考答案优先巢式PCR或全基因组扩增：前者两轮引物提高特异性，后者能从微量样品中扩出足量模板供下游使用。
参考答案Taq酶从温泉嗜热菌中分离，耐95°C高温不失活，让PCR真正自动化。这一思路也推动了其他耐热工具酶的开发。